HER2-Diagnostik allgemein
Unterschiedliche Testverfahren für unterschiedliche HER2-Alterationen
HER2-Alterationen finden sich bei einer Vielzahl solider Tumoren.1 In der Literatur werden drei unterschiedliche Alterationstypen beschrieben, deren Prävalenz je nach Tumorentität und Studie deutlich variiert.1
Informationen zu HER2-Alterationen
Für die pathologische Diagnostik ist entscheidend, welche HER2-Alteration nachgewiesen werden soll. Insbesondere ist zwischen HER2 Protein-Überexpression, HER2 (ERBB2) Gen-Amplifikation und HER2 (ERBB2) Gen-Mutationen zu unterscheiden.
Der Nachweis einer HER2 Protein-Überexpression erfolgt primär mittels Immunhistochemie (IHC), während HER2 (ERBB2) Gen-Amplifikationen in der Regel durch In-situ-Hybridisierungstechniken wie FISH oder CISH detektiert werden. HER2 (ERBB2) Gen-Mutationen erfordern den Einsatz molekularer Verfahren, typischerweise das Next-Generation-Sequencing (NGS). Welche Methode und welche Bewertungskriterien maßgeblich sind, richtet sich nach der zugrunde liegenden Alteration, der klinischen Fragestellung und der jeweiligen Tumorentität.
Für eine adäquate HER2-Diagnostik ist somit eine alterationsspezifische Methodenauswahl erforderlich – abhängig von klinischer Fragestellung, Tumorbiologie und Tumorentität.2–5
* ISH ergänzend je nach Tumorentität und klinischer Fragestellung, z. B. in etablierten Settings bei grenzwertigen IHC-Befunden
** Für das Mammakarzinom gelten die ASCO/CAP-Brustkriterien.3 Für andere solide Tumoren wird in diesem Kontext das HER2 IHC-Scoring nach den Kriterien für das Magenkarzinom angewendet.8
Testverfahren und diagnostische Einordnung unterschiedlicher HER2-Alterationen (mod. nach Robbins CJ, et al. 20256; Wolff AC, et al. 20232; Bartley AN, et al. 20177; Badve SS, et al. 20268)
Nachweis von HER2 Protein-Überexpression und HER2 (ERBB2) Gen- Amplifikation
Für Tumorentitäten, bei denen die HER2 Protein-Überexpression therapeutisch relevant ist, steht zunächst die immunhistochemische Testung (IHC) im Vordergrund.2 In etablierten Settings wie dem Mamma- und Magenkarzinom wird bei unklaren oder grenzwertigen IHC-Befunden ergänzend eine In-situ-Hybridisierung (ISH) zur weiteren Abklärung eingesetzt.2,7 Welche Scoring- und Bestätigungskriterien anzuwenden sind, ist jedoch tumorspezifisch zu beurteilen.
Auch über diese klassischen Indikationen hinaus gewinnt der standardisierte immunhistochemische Nachweis einer HER2 Protein-Überexpression bei weiteren soliden Tumoren an Bedeutung.6–8 Dies erhöht die Anforderungen an Präanalytik, Testdurchführung und tumorspezifische Befundinterpretation in der Routinediagnostik.
Durch eine an einem formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeschnitt angewendete Färbetechnik mit markierten Antikörpern können die HER2-Rezeptoren an der Zelloberfläche sichtbar gemacht werden. Unter dem Mikroskop werden Intensität und Ausmaß der Färbung beurteilt. Das Ergebnis wird allgemein über einen qualitativen IHC-Score von 0 bis 3+ ausgedrückt, wobei beim Mammakarzinom im unteren Teil des HER2-Expressionsspektrums noch weitere Subgruppen (wie HER2-low und HER2-ultralow) unterschieden werden.2,3
Eine ISH kann sowohl an frisch gefrorenem Tumormaterial als auch an FFPE-Tumormaterial durchgeführt werden. Dabei werden die HER2 (ERBB2) Gene durch speziell markierte DNA-Sonden sichtbar gemacht, die komplementär zu den relevanten genomischen Sequenzen sind.9
- Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) werden die Sonden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und die Signale mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops ausgewertet.9
- Die chromogene In-situ-Hybridisierung (CISH) wurde als Alternative zur FISH entwickelt. Dabei werden die DNA-Sonden mit sog. Chromogenen (Farbstoffen) angefärbt. Zur Auswertung genügt ein konventionelles Lichtmikroskop.9
- Die Sondenbindung kann aber auch über silberverstärkte In-situ-Hybridisierung (SISH) sichtbar gemacht werden. Die Auswertung der Signalzahl kann hier ebenfalls im Lichtmikroskop erfolgen.9
Beispiele für In-situ-Hybridisierungs-Verfahren bei Brustkrebszellen
(Bildquellen: F: Sui W, et al. World J Surg Oncol. 2009;7:83.10 C: van de Vijver M, et al. Breast Cancer Res. 2007;9:R68.11 S: Unal B, et al. Asian Pac J Cancer Prev. 2013;14(10):6131-4.12)
Da eine Gen-Amplifikation auch auf einer Polysomie, d. h. einer Vervielfachung des gesamten Chromosoms beruhen kann, wird bei der ISH oftmals noch eine zweite Sonde eingesetzt, die sogenannte Chromosomenzählsonde (Chromosome Enumerating Probe, CEP).13 Diese bindet an die zentrale Verbindungsstelle der beiden Chromatiden des Chromosoms, das Centromer. Bei der HER2 (ERBB2) Testung bindet diese Sonde an die Centromer-Region des Chromosoms 17, auf dem das HER2 (ERBB2) Gen lokalisiert ist. Durch diese duale Markierung werden sowohl das HER2 (ERBB2) Gen als auch das Chromosom 17 (CEP17) identifiziert und quantifiziert. Dadurch ist eine direkte Aussage über den Ploidiegrad parallel zur Bestimmung des HER2 (ERRB2) Amplifikationsstatus möglich.13
Ein typischer Fall Einsatzfall für eine Doppel-Sonden ISH ist die Analyse der HER2 (ERBB2) Gen-Amplifikation bei Brustkrebspatientinnen, um diejenigen zu ermitteln, die von einer auf HER2 ausgerichteten Therapie tatsächlich profitieren.14 Die ASCO/CAP-Leitlinie empfiehlt zur Bestimmung des HER2-Amplifikationsstatus in IHC 2+ Fällen eine ISH mit zwei Sonden (Dual-Probe-ISH-Assay).2
Präanalytik der HER2-Testung
Die zuverlässige Bestimmung des HER2-Status erfordert höchste Präzision in allen Phasen der Diagnostik. Fehlerhafte Einstufungen können unmittelbare therapeutische Konsequenzen haben. Daher ist eine besondere Sorgfalt von der Gewebeentnahme über die Fixierung und Aufarbeitung bis hin zur Färbung und Befundung unerlässlich.14,15
Insbesondere der immunhistochemische Nachweis der HER2-Expression ist empfindlich gegenüber präanalytischen Variablen. Faktoren wie Art und Dauer der Fixierung, Verfahren zur Antigenrückgewinnung, verwendeter Antikörperklon, Reaktionszeiten, Temperaturbedingungen und Substratkonzentration können das Färbebild und damit die Befundinterpretation beeinflussen.14,15 Die nachfolgenden Hinweise beziehen sich exemplarisch auf etablierte Anforderungen der HER2-Testung beim Mammakarzinom; je nach Tumorentität und Testsystem sind möglicherweise abweichende Vorgaben zu berücksichtigen.
- Die HER2-Testung kann sowohl an Stanzbiopsien als auch an Resektionspräparaten erfolgen.2,14,16 Entscheidend ist, dass die Zeit bis zur Fixation und die Fixationsdauer den empfohlenen Standards entsprechen (siehe Probentransport und -aufbereitung).14
- Beim Mammakarzinom wird die primäre Testung im Hinblick auf die Therapieplanung vorzugsweise an der Stanzbiopsie vorgenommen.2,14,16
- Gewebe mit artifiziellen Veränderungen, wie Randartefakten, Retraktionen oder Quetschungen ist von der Beurteilung auszuschließen.14
- Jedes Labor sollte seine Testmethodik für die jeweils untersuchte Tumorentität validieren. Bei etablierten HER2-Assays sind eine hohe Übereinstimmung und eine kontinuierliche Qualitätssicherung anzustreben.14
- Die Zeitspanne zwischen Gewebeentnahme und Fixation (kalte Ischämiezeit) sollte so kurz wie möglich gehalten werden und 60 Minuten nicht überschreiten.2,14,16 Ist dies nicht realisierbar, muss die Probe durchgehend bei 4 °C gelagert werden, auch während des Transports ins Labor.16
- Größere Gewebeproben sind unmittelbar nach makroskopischer Beurteilung im Abstand von 5–10 mm zu lamellieren (mindestens ein Gewebeblock pro cm Resektatlänge), um eine gleichmäßige und zügige Fixation sicherzustellen und Fixationsgradienten zu minimieren.2,16–18
- Die Fixation sollte in einem ausreichend bemessenen Volumen 10 %igem, neutral gepuffertem Formalin (entspricht ca. 4 % Formaldehyd) erfolgen.2,16–18 Das ideale Verhältnis von Gewebe- zu Fixativvolumen beträgt 1:10,16 mindestens jedoch 1:5.17
- Die folgenden Zeitfenster orientieren sich an etablierten Vorgaben für das Mammakarzinom und sind nicht ohne Weiteres auf alle Tumorentitäten übertragbar.
Die minimale Fixationszeit liegt bei 6 Stunden:2,14,16–18- Stanzbiopsien: optimal 6–72 Std.18
- Resektate: optimal 12–72 Std.18
- Nach 24 Stunden sollte das Fixativ durch eine frische Formalinlösung ersetzt werden.17
- Die Überschreitung einer Fixationszeit von > 72 Stunden ist zu vermeiden, da sie zu unspezifischer Hintergrundfärbung führen kann, aber auch die Antigen-Rückgewinnung verschlechtern und damit zum Verlust immunhistochemischer Signalqualität führen kann.17
- Die Fixation kann bei Raumtemperatur (15–25 °C) 19
- Das Vorwärmen des Formalins kann zwar die Fixationsgeschwindigkeit steigern, erhöht jedoch auch das Risiko der Autolyse. Zudem kann sich eine äußere Fixationsschicht („Fixierschale“) bilden, die das Eindringen des Fixativs in tiefere Gewebeschichten behindert.16,17
- Eine primäre Fixation mit Kühlung kann autolytische Prozesse verlangsamen, hemmt jedoch auch die Fixierung insgesamt. Ein zu frühes Abkühlen im Fixiermedium kann zu unzureichender Fixierung führen.16,17
- Nach der Fixierung werden die Gewebe in einer Alkoholreihe mit aufsteigender Konzentration dehydriert, gefolgt von Xylol. Anschließend werden die Proben mit geschmolzenem Paraffin (≤ 60 °C) infiltriert.19
- Ordnungsgemäß fixiertes und eingebettetes Gewebe ist vor dem Schneiden und Aufbringen auf Objektträger unbegrenzt haltbar hinsichtlich der (HER2-)Proteinexpression, wenn es bei 15–25 °C gelagert wird.19
- Für formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe (FFPE) wird eine Schnittdicke von 4–5 μm empfohlen.19
- Die Färbung sollte je nach Testsystem zeitnah nach dem Schneiden erfolgen:
- PATHWAY® anti-HER-2/neu (4B5): innerhalb von 1–2 Tagen20
- HercepTest™ mAb pharmDx (Dako Omnis): innerhalb von 4–6 Wochen19
Schnitte, die älter als 6 Wochen sind, sollten nicht mehr für eine HER2-Färbung verwendet werden.2
Die empfohlene Lagerungs- und Verarbeitungsdauer frisch geschnittener Präparate ist testsystemabhängig; maßgeblich sind die Angaben des jeweils verwendeten Assays.
- Eine übermäßige Trocknung der Schnitte kann zu einem Verlust des HER2-Antigens führen.17 Daher wird eine Trocknung empfohlen:
- bei 60 °C für 1 Stunde oder
- bei 37 °C über Nacht oder
- bei Raumtemperatur für mindestens 12 Stunden.17,19
- Vor der Färbung müssen die Gewebeschnitte entparaffiniert und anschließend rehydriert werden.
- Die Färbemethode, aber insbesondere die Antigen-Rückgewinnung sowie die Verwendung unterschiedlicher Antikörperklone mit variierender Spezifität, können die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse maßgeblich beeinflussen. Dies kann die sichere Einordnung der HER2-Expression erschweren, insbesondere bei grenzwertigen oder schwach ausgeprägten Färbemustern.21
- Zur Sicherstellung der Validität und Reproduzierbarkeit der HER2-Analyse werden standardisierte Testkits empfohlen. Die Durchführung sollte dabei strikt gemäß den Herstellerangaben erfolgen.14
- Für kommerzielle Testsysteme wie PATHWAY® anti-HER-2/neu (4B5) von Ventana und HercepTest™ mAb pharmDx von Dako wird der Einsatz validierter Färbeautomaten und abgestimmter Protokolle empfohlen.19,20
- Der Nachweis einer HER2-Genamplifikation erfolgt mittels In-situ-Hybridisierung (ISH). Dabei stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung:
- FISH: fluoreszenzbasierte ISH
- CISH: chromogene ISH
- SISH: silberverstärkte ISH
Auch hier gelten hohe Anforderungen an die Qualitätssicherung in der Routinediagnostik. Bei Einsatz von Testkits ist die Anwendung ausschließlich gemäß Herstellerprotokoll durchzuführen.14
- Studien zeigen, dass die Entkalkung von Knochengewebe die Genauigkeit der HER2-Bestimmung mittels IHC beeinträchtigen kann.22,23 Bislang existiert kein standardisiertes Entkalkungsprotokoll, das als Goldstandard für die anschließende IHC anerkannt ist.24
- Für die Bestimmung des HER2-Status in Knochenmetastasen wird daher bevorzugt die In-situ-Hybridisierung (ISH) empfohlen.25,26
- Die Entkalkung mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hat sich als geeignete Methode für die HER2 FISH-Analyse erwiesen.27,28
- Eine aktuelle Studie ergab, dass eine 10 %ige Ameisensäure keinen negativen Einfluss auf die HER2 IHC-Färbung hatte.29 Die Autor:innen schlussfolgern, dass eine Ameisensäure-Entkalkung prinzipiell zur Beurteilung von HER2-positivem sowie HER2-low Status geeignet sein könnte.29
Nachweis von HER2 (ERBB2) Mutationen
Der Nachweis aktivierender HER2 (ERBB2) Mutationen kann mittels Next-Generation-Sequencing (NGS) oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgen. Gemäß der aktuellen S3-Leitlinie zur Prävention, Diagnostik, Therapie und Nachsorge des Lungenkarzinoms sollen alle Patient:innen mit NSCLC Stadium IV vor der Erstlinientherapieentscheidung eine umfassende NGS-basierte Molekulardiagnostik erhalten.30 Dabei wird u. a. auch die Testung auf HER2 (ERBB2) Mutationen in den Exonen 8, 18, 19, 20 und 21 empfohlen.30
Abkürzungen
ASCO: American Society of Clinical Oncology; CAP: College of American Pathologists; CEP: Chromosome Enumerating Probe; CISH: chromogene In-situ-Hybridisierung; DNA: Desoxyribonukleinsäure; EDTA: Ethylendiamintetraacetat; ERBB2: v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog; FFPE: formalinfixiert, paraffineingebettet; FISH: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; HER2: humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (Gen); HER2: humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (Protein); IHC: Immunhistochemie; ISH: In-situ-Hybridisierung; mAb: monoklonaler Antikörper; NGS: Next-Generation-Sequencing; NSCLC: nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; PCR: Polymerase-Kettenreaktion; SISH: silberverstärkte In-situ-Hybridisierung
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